朱国胜 邱丽影 资 捷
广东省深圳市福田区妇幼保健院检验科 518045
卵巢癌是常见的且致死率最高的妇科恶性肿瘤,其中90%～95%为卵巢原发性癌,在中国女性癌症死亡原因中排名第七位。卵巢癌患者早期无明显的临床症状,且缺乏有效的早筛手段,因此早期诊断比较困难,约70%的病人确诊时已进入晚期。其标准治疗方案为细胞减灭术及药物化疗,但是经过治疗后大约25%病人在6个月后出现耐药型复发,病人5年生存率约为31%,10年生存率仅为15%[1-2]。卵巢癌对患者生命健康的危害及造成的社会负担十分巨大,而缺乏早期诊断方法和化疗耐药是导致卵巢癌致死率高的关键因素,因此,探寻卵巢癌发病机制和寻找卵巢癌的早期诊断标志物和治疗靶点具有非常重要的意义。
DDX5和DDX17是Dead-Box(DDX)RNA解旋酶家族中高度相似的两个成员,它们对RNA具有多种调节功能,参与转录起始、选择性剪切和miRNA加工等过程[3-4]。有研究表明,DDX5和DDX17在结肠癌等恶性肿瘤组织中出现异常高表达,与多种癌症的发生发展密切相关[5-6]。目前关于DDX5和DDX17在卵巢癌组织中表达的研究少见,具体机制尚未明确。本研究利用RT-PCR技术检测卵巢癌组织样本和正常卵巢上皮样本中DDX5和DDX17的mRNA表达水平,为揭示DDX5和DDX17通过调节miRNA来促进卵巢癌发展及侵袭转移的分子机制提供实验依据。
1.1 样本与细胞系获取 卵巢癌细胞系SKOV3购自中国科学院细胞库(中国上海)。选取37例因卵巢癌行切除的卵巢癌组织(试验组)及26例因良性病变行切除的正常卵巢上皮细胞(对照组)。试验组样本纳入标准：(1)符合卵巢癌诊断标准,并经病理学确诊为原发性卵巢癌;(2)从未接受放疗及化疗。上述卵巢癌组织和正常卵巢上皮细胞的收集经过患者知情同意后获取。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR检测DDX5和DDX17基因mRNA表达水平：按照Thermo TRIzol RNA提取试剂盒说明书要求提取卵巢癌组织及正常卵巢上皮细胞总RNA,并用Thermo逆转录试剂将总RNA逆转录合成cDNA。以该产物作为模板分别对目的基因 DDX5 和 DDX17 进行扩增,使用GAPDH为内对照,每样本做3复孔。反应体系：2xPower SYBR Green Master Mix 10μl,DDX5或DDX17的上下游引物均为2μl,β-actin 上下游引物均为2μl,cDNA 模版2μl,体系总体积为 20μl。在 PCR 仪中执行以下程序：94℃预变性5min;94℃变性15s,60 ℃退火40s,72℃延伸40s,40个循环。引物序列如下：DDX5 上、下游引物分别为5’-AGAGGTGATGGGCCTATTTGC-3’和5’-TCAAGCGACAAGCTCGACAAT-3’;DDX17上、下游引物分别为5’-GGATGTCTGCATGGAAAGTG-3’和5’-TCAGATCATCACAGCGTCTC-3’;内对照GAPDH上、下游引物分别为5’-ATTTGGCTACAGCAACAGG-3’和5’-TTGAGCACAGGGTACTTTATT-3’。
通过计算 2-ΔΔCt值,量化基因相对表达水平进行比较分析。由PCR扩增曲线得到了每个样品的目的基因和内参基因平均Ct值(阈值循环数),以一卵巢正常上皮细胞作为参照样品,基因相对表达量ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因,相对表达值ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组,mRNA 的相对表达量即为2-ΔΔCt。
1.2.2 建立DDX5和DDX17沉默细胞株,并检测细胞活性：构建针对DDX5和DDX17基因的pLKO.1 shRNA质粒,将上述质粒、对照质粒(pLKO.1-Scramble)分别与包装质粒pCMV-dR8.2和 pCMV-VSVG 共转染到293T细胞中进行包装,收集病毒上清。使用病毒上清感染卵巢癌细胞系SKOV3,48h后使用2μg/ml嘌呤霉素筛选5d,得到DDX5和DDX17基因稳定沉默细胞株,分别命名为shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2,用Western Blot验证。
将上述筛选获得的5种不同细胞株按相同数量接种于96孔板中,在37℃下培养72h,加入CCK-8溶液(10μl)到96孔板的培养基中。然后将混合物在37℃孵育2h,并使用分光光度计测量吸光度(OD)。
1.3 统计学方法 采用统计学分析软件SPSS22.0进行数据分析处理,两实验组比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 DDX5和DDX17在卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞的表达水平 通过实时荧光定量PCR实验分析37例卵巢癌细胞和26例卵巢正常上皮细胞中两基因的mRNA表达水平,结果显示(见图1)：相对于正常卵巢上皮细胞,卵巢癌组织中DDX5的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),而卵巢癌组织中DDX17的表达明显降低(P<0.01)。
图1 DDX5和DDX17 mRNA相对表达水平
2.2 沉默DDX5和DDX17卵巢癌SKOV3细胞株的增殖能力 通过转染分别使SKOV3细胞系中的DDX5和DDX17沉默,得到DDX5和DDX17基因稳定沉默细胞株,分别命名为shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2。Western Blot验证如下(见图2)：与shNC组对比,DDX5沉默细胞株DDX5的表达明显下调,DDX17沉默细胞株DDX17的表达明显下调。通过CCK-8检测发现,与shNC和DDX17沉默的卵巢癌细胞相比,DDX5沉默的SKOV3 细胞的增殖能力降低;DDX17沉默的卵巢癌细胞增殖能力与shNC对照组无明显差别(见图3)。
图2 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌细胞系中DDX5和DDX17表达
图3 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌细胞系体外增殖情况
DDX5和DDX17的核心区域是DEAD box家族保守的模体,具有90%的同源性,而N端和C端区域则同源性较弱,分别约为60%和30%[7],它们可能与不同 RNA底物或者蛋白相互作用,导致在细胞中存在不同功能。DDX5和DDX17已被证实通过与自身高度调控的转录因子相互作用并调节其活性,参与细胞的转录起始、选择性剪切和miRNA加工等生物学过程;与组织发育成熟及肿瘤发生转移密切相关,在癌症中同时扮演着促进和抑制的双重角色[8-9]。
DDX5和DDX17可与肿瘤细胞内转录因子形成复合物,调节相关基因表达,从而影响上皮—间质转化和肿瘤细胞增殖。在结肠癌中,DDX5和DDX17结合β-catenin,刺激β-catenin调控的c-Myc、cyclin D1等原癌基因的表达,从而促进结肠癌细胞的增殖;在实验鼠中,敲低DDX5和DDX17 的表达可以抑制结肠癌细胞的增殖,并减少肿瘤的形成。也有研究表明,血小板衍生因子(PDGF)会通过磷酸化DDX5促进肿瘤细胞上皮间质转换(EMT)过程[10]。
随着研究的深入,DDX5和DDX17在癌症发展过程中的抑制作用逐渐被研究者揭示。DDX5和DDX17是抑癌基因p53的共转录因子,对p53介导的DNA损伤应答至关重要,但DDX17同p53的相互作用要弱于DDX5,DDX5沉默会显著抑制p53在DNA损伤应答下对细胞周期抑制蛋白p21的转录激活作用[11]。另外,在许多癌症细胞中,Hippo信号通路会发生突变而失去功能。Mori M的研究发现,在肝癌细胞中失活的Hippo信号通路会导致YAP蛋白聚集在细胞核中,而YAP蛋白会结合DDX17,使其无法参与miRNA加工过程,最终导致许多肿瘤抑制相关miRNA水平降低,使肿瘤细胞生长加速;而过表达DDX17则会抑制Hippo通路失活引起的细胞过快生长[12]。
本研究利用荧光定量PCR技术检测36例卵巢癌液氮标本和27例正常卵巢上皮标本中DDX5和DDX17 mRNA表达水平,发现对比正常卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞中DDX5表达上升,而DDX17表达下降;沉默DDX5的卵巢癌细胞增殖能力降低,沉默DDX17的卵巢癌细胞增殖能力却无明显差别。这可能是DDX5可以通过无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)降低DDX17表达[13],卵巢癌中高水平的DDX5导致DDX17表达下降;也可能是在卵巢癌细胞中,DDX5和DDX17与不同的RNA底物或蛋白作用,在卵巢癌的发生发展过程中起着不同的作用。Iyer R Sumanth等发现DDX5沉默后极大地降低了质粒稳定性,而敲低DDX17对质粒稳定性没有明显影响,DDX5促进乳腺癌细胞DNA复制[14]。在卵巢癌细胞中,DDX5影响质粒稳定性,促进DNA复制因子表达,促进癌细胞增殖,DDX5的沉默会损害DNA复制因子表达,导致卵巢癌细胞增殖能力下降;DDX17对质粒稳定性没有明显影响,因此,沉默DDX17对卵巢癌细胞增殖能力影响不大。
本研究中卵巢癌细胞DDX5的表达上升,DDX17的表达下降,而既往研究中儿童髓母细胞瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤细胞DDX5和DDX17的表达水平均升高[15-16],可能是DDX5/DDX17既可作为自身高度调控的转录因子的激活因子,也可为抑制因子,其功能受细胞环境、DDX5/DDX17翻译后的修饰、特异的启动子被调控等因素影响[17]。卵巢癌细胞中DDX5和DDX17的异常表达提示DDX5和DDX17可能成为卵巢癌的生物学标志物。沉默DDX5的卵巢癌细胞增殖能力降低,说明在卵巢癌中,高表达的DDX5可能扮演一个癌基因的角色,起促进卵巢癌细胞发生增殖的作用,可作为卵巢癌治疗的一个潜在靶点。
综上所述,DDX5和DDX17在卵巢癌组织中显著异常表达,DDX5的表达情况会影响卵巢癌细胞的增殖,对卵巢癌的早期诊断具有一定价值。在后期研究中需进一步探究DDX5和DDX17在卵巢癌发生中的作用机制,探讨上下游的可能的调控因子,明确DDX5和DDX17通过哪个信号轴调控卵巢癌的发生发展。通过研究找到卵巢癌早期诊断标志物,争取通过检验发现早期卵巢癌,对后续开展靶向治疗提供基础,挽救更多患者的生命,为社会发展作出贡献。
猜你喜欢细胞株细胞系卵巢癌miR-181a在卵巢癌细胞中对顺铂的耐药作用昆明医科大学学报(2022年1期)2022-02-28Wnt3 a和TCF4在人卵巢癌中的表达及临床意义安徽医科大学学报(2016年12期)2017-01-15STAT3对人肝内胆管癌细胞系增殖与凋亡的影响山东医药(2015年14期)2016-01-12稳定敲低MYH10基因细胞株的建立医学研究杂志(2015年11期)2015-06-10microRNA与卵巢癌转移的研究进展医学研究杂志(2015年4期)2015-06-10抑制miR-31表达对胰腺癌Panc-1细胞系迁移和侵袭的影响及可能机制江苏大学学报（医学版）(2015年2期)2015-04-17Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达中国当代医药(2015年16期)2015-03-01稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH—7细胞株的建立中国医药导报(2015年27期)2015-02-28E3泛素连接酶对卵巢癌细胞系SKOV3/DDP顺铂耐药性的影响中国医药导报(2015年26期)2015-02-28CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定癌变·畸变·突变(2014年2期)2014-03-01