唐诗琴，李小静
长期以来，以白念珠菌（Candida albicans）为主的真菌感染威胁着人类的健康，特别是免疫缺陷的群体。随着越来越多抗真菌药物及免疫抑制剂的使用，白念珠菌的耐药也成为了一个严重的问题，而导致这种情况最重要的一个因素就是生物被膜（Biofilm）的形成。生物被膜存在于包括植物和哺乳动物组织在内的天然基质上，并易在人造聚合物上形成，如在导管、假体和植入的心脏瓣膜中被发现［1］。正因为白念珠菌生物被膜的存在，所以白念珠菌相关感染疾病对临床抗真菌药物有很大的耐药性，增加了白念珠菌感染的复发率，使临床治疗也变得困难。因此，需要寻找新的治疗靶点去降低白念珠菌病的发病率和复发率。
生物被膜是一群附着在生物或非生物基质上的微生物，嵌入细胞外聚合物基质中，是许多微生物的主要生长状态。白念珠菌生物被膜的形成主要由酵母细胞、假菌丝和菌丝通过表面接触粘附而形成的一种复杂网状混合物的三维结构［2］。白念珠菌生物被膜的发育是渐进的，生物被膜的形成常分为4 个阶段（图1）：白念珠菌酵母细胞在底物上的吸附，形成基底层（基底层起锚定作用）、微菌落的形成和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的产生，成熟阶段，细胞从成熟生物被膜中的分散［3］。生物被膜内的假菌丝与菌丝细胞形成一个复杂的网络，不断向周围延伸扩散。
1.1 生物被膜与粘附 粘附是生物被膜初步形成的第一步，而生物被膜完整性是整个生物被膜形成重要的第一步。在粘附过程中，单个酵母细胞一般会粘附在物体表面，启动生物被膜形成的阶段。此时的酵母细胞还可以重新回到浮游状态，所以在这个阶段，生物被膜的形成是相对可逆的。在粘附过程中有两个重要物质：转录因子与黏附素。白念珠菌中研究最多的黏附素家族是Als（Agglutinin-like sequence，凝集素样序列）蛋白家族，Als 蛋白家族是白念珠菌生物被膜形成和发展的基础，Als1、Als3 和Als5 在白念珠菌与宿主细胞相互粘附过程中发挥着重要作用；
Als1除了在粘附中的作用外，还对真菌细胞大小有一定影响［4］。Hwp1、Rbt1、Eap1 和Ywp1 都是糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl phosphatidyll inositol，GPI）锚定细胞壁蛋白，其中Hwp1 是重要的粘附因子，它是菌丝特异性细胞壁蛋白，能调控生物被膜中的菌丝形成，并且促进白念珠菌与宿主细胞的粘附［5］。研究发现，当Als3 或Hwp1 基因缺失的时候，生物被膜形成的能力受到抑制，可导致毒力减弱［6，7］。通过与浮游细胞状态进行比较后，确定了3 个新的生物被膜形成的调节因子：Flo8、Gal4 和Rfx2［8］。在生物被膜形成全程中都需要Flo8 因子的参与，而在中期发育中需要Gal4 和Rfx2 因子的参与才能形成较完善的生物被膜，靶向白念珠菌中的Flo8 因子会引起针对多种微生物感染的保护性免疫反应。在将来，生物被膜调节因子与黏附素家族的进一步研究有希望成为治疗白念珠菌感染的一种方法。
1.2 生物被膜与菌丝 白念珠菌和其它真菌不同之处在于它可以在各种条件下形成酵母细胞和菌丝，菌丝是生物被膜形成的重要成分［9］。在生物被膜形成过程中，一些核心调节因子比如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1 均参与了浮游细胞的生长［10］，但是悬浮培养中的菌丝，容易形成有缺陷的菌株，不利于生物被膜形成，这些调节因子有促进菌丝形成的作用，若将它们在浮游条件下培养，其中一个基因缺失，都会抑制或降低白念珠菌的菌丝形成，进一步影响生物被膜［11］。在菌丝调控中有2 个重要的信号途径，包括MAPK（Mitogen-activated protein kinase，丝裂原激活蛋白激酶）信号途径、cAMP-PKA 信号途径。Cek1是一种胞外信号调节激酶，是MAPK家族的重要成员，它能参与调控细胞表面接触反应，在菌丝侵入性生长以及生物被膜形成中发挥一定的作用；
cAMP-PKA 通路在真核细胞中比较保守，并能调节白念珠菌毒力，所以它们可能是抗真菌药物开发的有希望靶点［12-14］。生物被膜中的菌丝对整个生物被膜结构起着重要的稳定性作用，是酵母细胞和其它菌丝支撑起来的框架。β-葡聚糖（β-glucan）的合成会影响白念珠菌生物被膜形成能力，研究发现当生物被膜成熟以后，它顶层的菌丝细胞更具有掩盖β-葡聚糖的能力，侵入性生长过程中穿透上皮细胞层，并通过物理刺穿吞噬细胞，避免免疫系统识别，引起免疫逃逸［10］。虽然菌丝细胞本身就有β-葡聚糖，但如果是未成熟的或是量不够的菌丝细胞，就不能达到遮盖引起逃逸的作用。因此，形成菌丝、菌丝与酵母粘附的能力对生物被膜的发育和维持至关重要，可以利用以上特性进一步破坏生物被膜形成的条件。
1.3 生物被膜与细胞外基质 细胞外基质的研究一直以来是了解白念珠菌耐药的一个重要方向，但它基质成分比较复杂。细胞外基质由生物被膜内细胞分泌的胞外聚合物组成，是糖蛋白（55%）、碳水化合物（25%）、脂质（15%）和核酸（5%）构成的复杂混合物质，其中碳水化合物主要是α-甘露聚糖（α-Mannan）和β-1，6-葡聚糖多糖（β-1，6-glucan polysaccharide），其次是β-1，3-葡聚糖（β-1，3-glucan）［15］。生物被膜一般比浮游细胞要厚，并且抗耐药性强。将生物被膜基质视为白念珠菌生物被膜的一种胞外酶活性成分，一种既能分解分子来作为保护性反应又能获得营养来源的成分。细胞外基质在生物被膜中处于保护白念珠菌生物被膜完整性不受损的角色，这是外来干预措施攻破生物被膜的关键一步。β-1，3-葡聚糖是白念珠菌细胞外基质中的一种重要多糖，它利用自身的特殊性能在唑类药物恢复力中起主要作用［16］，而β-1，3-葡聚糖酶具有抗生物被膜活性，它可以降解白念珠菌生物被膜的中β-1，3-葡聚糖，因此β-1，3-葡聚糖酶可能是一种有用的抗生物被膜剂［17，18］。
1.4 生物被膜群体效应 群体效应（Quorumsensing，QS）是一种微生物通讯机制，其信号分子的积累使细胞能够感知细胞密度，是生物被膜形成的基础。白念珠菌中发现的真菌群体效应信号分子包括法尼醇（Farnesol））和酪醇（Tyrosol）［19，20］。法尼醇是白念珠菌中甾醇生物合成的前体，是目前研究最多的群体效应信号分子，它能抑制白念珠菌从酵母向菌丝形式转化，还能影响生物被膜细胞粘附、成熟发育以及内部的结构［21］。之前研究通过XTT 细胞活性测定法检测法尼醇对生物被膜的作用，发现在37.5—600μm 浓度范围内，法尼醇对白念珠菌生物被膜具有浓度、时间及种类依赖性的抑制作用［22-24］。作用仅次于法尼醇的群体效应信号分子是酪醇，它不仅促进菌管的形成，还促成白念珠菌从酵母形式向菌丝形式的转化［25］，酪醇在生物被膜形成早期和中期阶段的作用最显著。如果利用酪醇和法尼醇的各自特性结合，可能针对抗白念珠菌的治疗有一定帮助。因法尼醇是甾醇生物合成的前体，所以白念珠菌生物被膜中的法尼醇暴露后，会导致麦角甾醇（Ergosterol）生物合成基因的下调，因此法尼醇可通过影响麦角甾醇生物合成中的部分基因表达来抑制生物被膜介导的耐药性［26］。在未来的研究中，可以尝试用法尼醇作为减少白念珠菌生物被膜的替代剂。
白念珠菌耐药因素很多，生物被膜耐药是主要原因之一。白念珠菌生物被膜比浮游细胞更具抗性，对抗真菌药物不敏感，从而产生临床耐药性。生物被膜耐药性形成机制复杂，其中主要机制包括：药物外排泵的表达增加、细胞外基质保护作用及生物被膜中存在“持久性”细胞［10］。外排泵是存在细胞质膜中的转运蛋白，一般在生物被膜中就有表达，主要对唑类药物分子进行排泄，当使用氟康唑后，外排泵表达更明显，不断将药物分子从细胞内部输送到细胞外，这样就降低了作用部位的药物浓度。持留细胞（Persister cells）是代谢活性降低的非分裂细胞，它们不仅对抗菌药物具有高度耐药性，也可能在药物治疗后播种新的生物被膜感染。生物被膜在成熟阶段会释放出大量的细胞外基质，它就像一层保护膜，可以作为物理屏障阻挡抗真菌药物的渗入，并保护和维持生物被膜的完整性。
目前有4类药物被广泛用于抗真菌：唑类衍生物、多烯、棘白菌素和核苷类似物。氟康唑具有抗真菌谱广、毒性低、生物利用度高等特点，被广泛用于白念珠菌感染的临床治疗。麦角甾醇作为白念珠菌生物被膜的组成成分，是发挥毒力的重要结构，使用氟康唑能抑制麦角甾醇合成。因为氟康唑是抑菌剂，且对于细胞膜的渗透性比较差，不仅影响药物浓度，还易引起耐药，所以现在非抗真菌药物与抗真菌药物的协同治疗逐渐引起大家的关注，这里主要描述氟康唑耐药时的协同治疗。
布洛芬是常见的非甾体抗炎药（NSAID），多用于缓解急性疼痛和发热［27］。非甾体抗炎药可以通过花生四烯酸途径，减少前列腺素E2 的产生，限制致病真菌的毒力，并减少生物被膜形成［28］。研究发现，布洛芬能在体内增强氟康唑的抗真菌活性并降低白念珠菌的毒力，破坏真菌生物被膜［29］。不仅如此，布洛芬还是生物被膜外排泵阻滞剂，能够防止唑类药物从细胞内排出。布洛芬与唑类药物的协同作用使抗真菌敏感性增加的原因可能是细胞内真菌药物浓度增加，逆转了生物被膜的耐药［30］。氯尼达明（Lonidamine，LND）是一种非常规的抗肿瘤药物，可通过抑制糖酵解途径干扰癌细胞的能量代谢。Chen等人［31］通过使用氯尼达明与氟康唑联合作用对耐药性浮游白念珠菌和预形成的生物被膜进行抑菌试验，发现氯尼达明和氟康唑协同作用下对早期（4h 与8h内）新形成的生物被膜有较强的抑制作用；
当12h 后，对生物被膜几乎无协同作用。这就提示氯尼达明和氟康唑的协同作用可以对生物被膜的产生有一定的抑制作用，但这仅适用于早期未成熟的生物被膜，对晚期已成熟生物被膜作用有限或几乎无作用。
白念珠菌的致病性主要取决于生物被膜，形成生物被膜的能力是一个极其复杂的过程，因此使白念珠菌相关感染的治疗变得复杂。生物被膜形成、抗真菌药物特性和多种微生物内的相互作用一直是白念珠菌生物被膜持续研究的热点，目前仍有许多机制等待着我们继续探索。今后我们应在注重真菌共生与感染之间平衡的同时，利用现有的知识去发现更多对抗白念珠菌感染的方法及研究生物被膜形成机制。
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